少年經歷

顧允成，字季時，號涇凡，明嘉靖三十三年（1554年）十月二十九日生于無錫涇里（今張涇），自幼家境清貧，性情耿直剛烈。其父顧學曾任鄉里亭長，經營過豆腐糧米等小作坊買賣，為人豪放，頗多見聞，因此注重顧家兄弟的教育。顧允成自幼聰敏，十四歲師從張少弦，萬歷元年（1573年）得補郡諸生。當時常州知府施觀民創辦龍城書院，顧憲成、顧允成兄弟都被選送其中，在龍城書院接受良好教育。

中第遣歸

萬歷十四年（1586年），顧允成赴殿試，對策切中時事毫無隱諱，直接評議皇帝寵妃、立儲之事。由于顧允成的言辭慷慨激烈，令閱卷官何心泉驚駭不已，想棄之不用。幸得大學士王錫爵取閱后決定錄取，但僅僅置于榜末。

中進士后顧允成尚未被授予官職，此時恰遇南京督學御史房寰上疏詆毀海瑞。顧允成倍感憤慨，與彭遵古、諸壽賢聯名上疏，彈劾房寰是出于對賢者的妒忌而誣蔑正直的大臣。當時房寰誣告海瑞一事，朝中官員大多切齒憎惡，但朝廷故意維護，只象征性批評房寰。 待到顧允成上書，朝廷即稱房寰已被處分，顧允成等人是越級妄奏，命奪去三人冠帶，遣返歸家反省。并責令九卿約束辦事的進士，今后不得妄言時政。當時南京太仆卿沈思孝上疏替顧允成等說情，結果也被責罰。

復起再貶

不久后，南京御史陳邦科請求錄用顧允成等人，未被準許。萬歷十六年（1588年），南京巡按御史再次上奏推薦，顧允成得以起任南康府教授。此后歷任保定府教授、國子監博士、禮部主事等職。

萬歷二十一年（1593年），皇帝下詔“三王并封”。顧允成與張納陛、岳元聲合疏直諫，認為絕不可行，并稱：“自明朝建立以來，嫡長子被封王（而非太子）的事不曾有過，王錫爵怎能專斷此事，皇上豈能（違背祖訓）獨創此事。”此前已有朱維京、王如堅、涂杰、王學曾等官員進諫而被貶謫，上書諫止的官員越來越多，皇帝知道不能全部懲處，只命遵旨行事。

不久后，吏部尚書孫鑨等因為再提此事而被責罰。顧允成又主持公道，上疏指責閣臣張位，還牽涉到王錫爵。張納陛也隨之附和上書。皇帝看后震怒，以忤旨罪名將顧允成貶為光州判官，張納陛貶為鄧州判官。顧允成沒有領旨赴任，而是請辭歸家，此后不再復出。

隨兄講學

萬歷二十二年（1594年），顧憲成亦遭革職還家。兄弟二人決定從事講學活動，宣揚自己的政治主張。自萬歷二十二年（1594年）至萬歷三十一年（1603年）的十年時間里，顧允成與顧憲成一起在故里講學。江南學人聞風趨赴，涇里客舍到處都住滿前來聽講者。張涇在當時成為江南無錫地區學術思想傳播的重要活動中心。

萬歷三十二年（1604年），顧氏兄弟決定修復無錫城內的東林書院，得到許多地方人士乃至常州知府、無錫知縣的資助和支持。同年十月，顧允成與顧憲成、高攀龍、安希范、劉元珍、錢一本、薛敷教、葉茂才（東林八君子）等人發起東林大會，制定了《東林會約》，規定每年舉行大會一、二次，每月小會一次。

東林書院修復后，顧允成與顧憲成常年寒暑不綴，早出晚歸，為講學奔忙。由于書院內江南遠近士人云集，顧氏兄弟在主持講會時既要與人發言討論、酬答釋疑，同時還要負責安排赴會學人的膳食寢居。當時無錫城內除東林書院外，顧家別無其他棲息之所。為便利講學，免除奔波勞苦。顧允成于書院修復次年，出資在東林書院后購置一塊宅基，建成“小辨齋”，作為他在城內的居息講學之所。

逝世追封

萬歷三十五年（1607年）六月二十一日，顧允成病逝于小辨齋內，享年五十四歲。留有《小辨齋偶存》八卷（附《事定錄》三卷）等著述。

明朝天啟年中，顧允成與張納陛同受朝廷追贈為光祿少卿。